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容故纳新-靶向新星:NTRK1/2/3融合基因检测

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发布时间:2018-12-04
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美国时间11月26日,Bayer和Loxo Oncology公司联合宣布抗癌药物拉罗替尼(Larotrectinib,商品名Vitrakvi)在美国正式上市,靶向NTRK融合基因的小分子药物Larotrectinib可能成为继PD-1单抗药物Keytruda(Pembrolizumab)之后的下一个“异癌同治”的典范。多项研究均推荐采用多种方法(FISH+NGS+PCR)联合检测NTRK1/2/3融合,避免NTRK1/2/3阳性患者漏检,丧失治疗机会。


2017年12月下旬,Bayer和Loxo Oncology公司合作开发的口服选择性原肌球蛋白相关激酶(Tropomyo-sin-related kinase,Trk)抑制剂Larotrectinib在美国递交新药上市申请、用于治疗携带NTRK融合基因的成人或儿童实体瘤。之前Larotrectinib已被FDA授予孤儿药资格和突破性疗法认定。该事件是精准医学走向实践的重要一步,也是基于精准医学设计的创新性临床试验-篮子试验(Basket Trial)的又一伟大实践。


Larotrectinib的疗效数据早在2017年6月的ASCO会议就已公布:在I期和II期临床试验中,共招募了55例涉及13种不同肿瘤类型的NTRK融合患者,包括垂体腺瘤(12人)、肉瘤癌(10人)、婴儿纤维肉瘤(7人)、肺癌(5人)、甲状腺癌(5人)、结直肠癌(4人)、黑色素瘤(4人)、胆管癌(2人)、胃肠道间质瘤(2人)、其他癌症(4人),其中46个可评估的患者整体反应率为78%,有2位患者肿瘤完全消失,最长应答时间达23个月。



紧接着,2018年10月举行的欧洲肿瘤医学协会会议(ESMO2018)上,一项关于抗癌药Larotrectinib治疗涵盖24种独特肿瘤类型的TRK融合成人,及儿童患者的临床数据显示:总缓解率:80%;部分缓解率:62%;完全缓解率:18%。临床数据充分证明了Larotrectinib用药持久的有效性和安全性。


Larotrectinib是一个靶向药,针对的是NTRK1、NTRK2或者NTRK3基因融合的肿瘤患者。简单来讲这个新药不需要考虑癌症的发生区域,这就意味着不管什么癌种(组织/细胞/部位),只要有NTRK基因融合,就可使用Larotrectinib进行治疗。


Larotrectinib说明书中也明确指出其适应征:


所以,晚期不可手术癌症患者可做基因检测,如果有NTRK1/2/3融合基因,那么就可考虑使用Larotrectinib进行靶向治疗。因此基因检测是用药的前提, 那么基因检测是如何指导用药就需要了解两个问题:1. 什么是NTRK融合基因? 2.NTRK融合基因如何检测?


1.什么是NTRK融合基因?

原肌球蛋白相关激酶 (tropomyosin-related kinase,Trk) 是一类神经生长因子受体,其家族由高度同源性的原肌球蛋白相关激酶A(tropomyosin-related kinase A, TrkA)、原肌球蛋白相关激酶 B (TrkB)、原肌球蛋白相关激酶C(TrkC)组成,分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3编码(图A)。Trk激酶通过配体所诱导的二聚化发生自我磷酸化,从而激活Ras/MAPK、P13K/AKT、PLCγ等下游信号通路,参与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生命活动(图B)。当染色体异常发生NTRK基因融合,与NTRK融合的配偶体可模拟配体诱导的二聚化而发生自我磷酸化,即可不接受配体的介导激活下游通路,促进细胞增殖分化,最终导致肿瘤的发生(图C)。Larotrectinib具有Trk激酶抑制活性,通过与ATP竞争结合位点实现抑制激酶催化活性,从何抑制肿瘤的发生。



NTRK基因融合出现在多种成人和儿童实体瘤之中,包括乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌,以及各种肉瘤中(表1)。



在常见的癌症中,NTRK基因融合的发生率较低,大致为1%-3%;但在一些罕见的癌症中,如婴儿纤维瘤,类似乳腺分泌癌,乳腺分泌型癌等,NTRK基因融合的发生率可达90%以上(表2)。



2.NTRK融合基因如何检测?

目前NTRK融合基因检测方法有:NGS、FISH、RT-PCR、IHC几种,但Larotrectinib说明书中仅指出检测方法为NGS和FISH,Larotrectinib临床试验中也将二者作为NTRK融合阳性患者筛选方法。



下面以几个临床案例来探讨各方法在检测NTRK基因融合中的应用。


案例一:

男性,45岁,30年吸烟史,在2013年被诊断出患有IV期肺腺癌;

进行四项化疗,疾病进展并脑转移;

AMP:SQSTM1-NTRK1,FISH进一步确定NTRK1重排;

进行Entrectinib  400mg/㎡ PO daily治疗;


 

使用Entrectinib治疗,分别是治疗7天(图A/C),26天(图C/D),155天(图E/F)的胸部CT,上排为横断面,下排为冠状面。CT结果显示肿瘤明显减少。表明Entrectinib对携带SQSTM1-NTRK1基因的NSCLC患者显示出显着的抗肿瘤活性。



案例二:

36例肺腺癌患者使用NGS检测2例含有NTRK1重排,分别为MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1融合基因(图a),并同时运用NTRK1断裂探针进行FISH检测显示绿色(5')和红色(3')信号明显分离,证实了MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1重排(图b)。






案例三:

41岁女性,诊断为具有转移至肺的软组织肉瘤的肿瘤;NGS检测LMNA-NTRK1基因融合(图A);NTRK1 FISH显示在肿瘤细胞核中观察到分离的红色信号(红色箭头)(用DAPI染成蓝色),表明染色体缺失导致NTRK1基因融合(图B);以LMNA(5')和NTRK1(3')为引物的RT-PCR产物的DNA测序色谱图表明LMNA的外显子2和NTRK1的外显子11之间融合(图C)。



使用Larotrectinib治疗,CT扫描显示胸腔横断面和冠状面图像,分别为开始LOXO-101临床试验之前(A),在研究中给予Larotrectinib治疗之前的基线成像(B),以及给药后1个周期(28天)(C)和4个周期(4个月)(D)的基线成像。图像显示最初为快速疾病进展(A-B,13周间隔),随后是显着的肿瘤减小,大量肺转移的肿瘤减小或分辨率降低(B-D,4周和16周间隔)。


 

以上三个案例均同时采取AMP-FISH及NGS-FISH方法联合检测策略,最终确定NTRK阳性的患者,从何进行靶向用药,且用药受益良好。


小结FISH,NGS和PCR方法优劣


1. FISH:

高敏感性和特异性,NTRK的融合形式很多,较RT-PCR而言FSIH方法能检出所有的融合形式,FISH NTRK1/2/3商品化探针的出现为FISH方法的应用提供了较好的保障。NTRK1/2/3 FISH技术适用的组织样本类型:10%中性福尔马林固定后石蜡包埋标本(FFPE样本),防脱玻片切片厚度3-5μm。


目前传统FISH检测对于操作和判读技术要求较高,且耗时长。但随着近年来生物技术的发展,一些快速探针的问世也大大缩短了FISH实验的时间,可将传统的过夜杂交缩短为2小时,为临床诊断提供了更加及时可靠的帮助,使FISH阳性的患者能从靶向药物明显获益。


2. NGS:

灵敏度高、可发现丰度较低的融合基因reads、目前临床实验使用占较大比例,但并没看到不同丰度reads的融合对疗效有何影响的相关报道。一般而言,NGS检测需从FFPE或新鲜样本中提取几十ng以上的RNA,用于建库及捕获。然而,不同大小的NGS panel往往需要设计RNA或DNA探针,来捕获这三个基因,特别是较大的NTRK2和NTRK3基因(DNA片段分别长达39万和35万碱基对),外显子较多,融合类型复杂且分布不一,且只能针对已知融合位点(序列)设计捕获探针,成本较高,且不同厂家的panel性能可比性还有待积累。Loxo Oncology公司在官方网站上也罗列了10种NGS panel供参考,在国内相关NGS独立实验室的panel性能还未见有较权威的验证数据发表。


3. RT-PCR

RT-PCR法检测NTRK1/2/3融合基因的特点在于快速、简便易行、能同时明确NTRK1/2/3已知的融合变体的类型。由于RT-PCR对于RNA的质量要求较高,结果容易出现假阴性和假阳性。此外,NTRK1/2/3融合变体很多,不能排除仍有未知融合变体的存在,相比FISH方法检测NTRK1/2/3融合基因能检出所有的融合的特点相比,无法检测未知的融合型是RT-PCR最大的不足之处。这些因素限制了RT-PCR在NTRK1/2/3融合基因诊断中的应用。


NTRK1/2/3检测的总体原则:应综合获取的各类生物材料的特征、分子检测方法的特点、实验室自身条件,进行多学科大协作,合理采取有效检测方法和流程,当怀疑一种技术的可靠性时,可以考虑采用另一种技术加以验证。


推荐采用多种方法(FISH+NGS+PCR)联合检测NTRK1/2/3融合,避免NTRK1/2/3阳性患者漏检,丧失治疗机会。


部分参考文献:
Anna F. Farago,JCO Precis Oncol. 2018 ; 2018
Drilon ,N Engl J Med. 2018 February 22; 378(8): 731-739
Biagio Ricciuti, Med Oncol (2017) 34:105
Anna F, J Thorac Oncol. 2015;10: 1670-1674




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